A partire dal 1492 le varie scuole sparse per la città furono riunite nell'attuale sede che venne ampliata con l'acquisto dei palazzi adiacenti fino ad occupare tutto l'attuale isolato. I lavori principali ebbero luogo tra il 1542 e il 1601 e furono iniziati da Andrea Moroni e continuati, alla sua morte nel 1560, da Vincenzo Scamozzi. L'ala su Riviera Ponti Romani è opera dell'aretino Guido Fondelli (1922), mentre la parte porticata, che guarda Via S. Canziano, nel XIV secolo ha incorporato il Palazzo dell'antica famiglia Capodivacca. Entrando dalla Porta della Vacca troviamo il cortile nuovo, ristrutturato tra il 1939 e il 1945. Il Cortile Antico, sovrastato dall'alta torre medioevale dell'orologio, è un elegante chiostro cinquecentesco che fu attribuito ad Andrea Moroni, ma assegnato da altri al Sansovino. Il cortile, l'atrio, le scale, le logge e le sale sono completamente rivestite all'interno da stemmi collocati da studenti e professori che frequentarono l'Ateneo dal 1542 al 1688. Dalla loggia superiore possiamo accedere alla Sala delle lauree di Medicina, del XIV secolo. A nord ovest il famoso Teatro Anatomico, il primo in Europa, ideato nel 1594 dal celeberrimo patologo Girolamo Fabrizi d'Acquapendente e inaugurato nel gennaio del 1595. Il teatro, unico nel suo genere, anche perché solamente qui si potevano sezionare cadaveri a scopo scientifico, è composto da sei piani ellittici in legno, capaci di 300 posti a sedere, che si alzano intorno al tavolo anatomico. A nord-est la Sala dei Quaranta, così denominata per i quaranta ritratti di studenti stranieri illustri, dove si trova la cattedra di legno dalla quale Galileo Galilei avrebbe insegnato matematica e fisica dal 1592 al 1610. Subito dopo l'Aula Magna con il prezioso soffitto affrescato dal Carlini nel 1854. La parete di fondo dell'aula, con i seggi del Senato Accademico, fu invece ricostruita nel 1942 su disegni di Giò Ponti, autore anche della basilica. Dalla Basilica, decorata con mosaici, affreschi e statue di autori contemporanei, si accede alla Sala del Collegio Accademico con scaffali scolpiti, colonne e arredi lignei un tempo della Biblioteca del Monastero di Santa Giustina.